En The Binding of Isaac, la estructura de las mazmorras está generada aleatóriamente. Igualmente, hay cuatro habitaciónes que están siempre presentes en los tres primeros capítulos: la habitación del tesoro, la habitación del jefe, la tienda, y el cuarto secreto. A partir del cuarto capítulo desaparecen la habitación del tesoro y la tienda, dejando solo la habitación secreta y el cuarto del jefe. También existen tres habitaciones mas, que pueden aparecer ocasionálmente, la habitación de desafio, el salón de juegos o la habitación del minijefe.
Distribución de las habitaciones
Las habitaciones pueden contener de una a cuatro puertas, piedras, heces, enemigos, fuego, fosas, cofres y objetos. Las habitaciones normales pueden ser habitaciones puzzle, donde el jugador puede intentar sortear unos obstaculos para conseguir objetos, o habitaciones de combate, donde el jugador debe derrotar a todos los enemigos antes de poder salir (en ocasiones puede aparecer un botín en el centro de la habitación al derrotar a todos los enemigos, que puede ser un corazón, una moneda, una llave, una bomba, o raramente una bomba troll)
La distribución de las habitaciónes al igual que la estructura de las mazmorras está generada aleatóriamente, con un número o tipo de enemigos distintos (en diferentes posiciones), piedras (pueden ser de diversos tipos), cofres y objetos.
La habitación del tesoro, la tienda, la habitación del jefe, la habitación del desafío, el salón de juegos y la habitación del minijefe solo pueden tener una habitación normal adyacente a ellos.
Habitación del tesoro 
Una habitación del tesoro
La habitación del tesoro (también llamada habitación o cuarto del objeto) es una habitación sin enemigos, con un objeto en el centro de un pedestal. Siempre hay una en los niveles de los tres primeros capítulos. Para entrar se necesita una llave (excepto en el primer nivel del primer capítulo, donde no hace falta), o dos bombas en caso de que haya una habitación secreta adyacente. La habitación del tesoro está se identifica por tener una puerta con el borde dorado en el juego, y por una corona dorada en el mapa.
Tienda 
Para entrar el jugador necesita una llave, o dos bombas en caso de que haya una habitación secreta adyacente. En esta habitación el jugador puede comprar objetos a un hombre ahorcado. Los precios son:
Una tienda con varios objetos a la venta
- 3 monedas por corazón
- 5 monedas por bomba, llave, corazones de fé, pildoras y cartas de tarot.
- 15 monedas por objeto de mejora o objeto utilizable
A veces los precios pueden verse reducidos a la mitad, en cuyo caso se mostrará el precio en rojo. En raras ocasiones, los objetos podrán cambiarse a cambio de un número de corazones de la vida máxima del jugador, como ocurre en la habitación del diablo. El minijefe del pecado "Codicia" aparece en ocasiones en esta habitación, reemplazando a la tienda en ese nivel aunque sea derrotado.
Las tiendas suelen vender la Escaler, las Pilas, el Descuento de Steam, el Libro de las Revelaciones, el Mapa del Tesoro, y la Brujula. Otros objetos también aparecen, pero poco a menudo.
Ocasionalmente, los objetos ofertados en la tienda pueden cambiar despues de una visita. Esto puede ser un error del juego. (Los objetos rebajados suelen cambiar cuando el jugador completa una habitación del desafio)
Si el jugador posee el Rosario, pueden haber objetos duplicados en la tienda.
Habitación del mendigo
Una habitación del mendigo.
La Habitación del Mendigo es un cuarto que aparece aleatoriamente con un mendigo en el centro. Esta habitación aparece como una maquina tragaperras en el mapa, ya que el mendigo al igual que la maquina tragaperras es un juego de suerte.
Chocar con el hace que el jugador pierda una moneda y da la posibilidad de que el mendigo haga aparecer una llave, una bomba, una bomba troll, un corazón, un corazón de alma o un objeto. Se puede chocar contra el las veces que el jugador quiera, perdiendo una moneda en cada choque, hasta que el mendigo deje caer un objeto de mejora o un objeto utilizable, momento en el que desaparecerá de la habitación.
Los mendigos pueden matarse con bombas, al morir dejan caer un objeto comun (corazones, bombas, llaves, monedas)
Es posible que haya mas de una habitación de mendigo en un mismo nivel, ya sea por casualidad o porque se ha usado la carta de Juicio del Tarot.
Habitación del jefe
Encuentro con Larry Jr.
Para escapar de cada uno de los niveles el jugador debe entrar a esta habitación y derrotar al jefe (a no ser que se utilice el objeto "Necesitamos adentrarnos mas". La habitación del jefe se indica en el mapa como un craneo, y en el juego se reconoce porque la puerta que lleva a el tiene un craneo en el marco.
Los jefes dejan caer objetos (dependiendo del jefe, puede ser objeto de mejora (jefes comunes), un objeto unico que solo deja caer un jefe determinado (jefes alternativos, jinetes del apocalipsis) o un objeto de la habitación del diablo (El Caido)), de uno a tres corazones (dependiendo de si el secreto "Todo es terrible" está desbloqueado o si el jefe tiene un color alternativo), y una trampilla al siguiente nivel.
Aunque se de el caso de que hay una habitación secreta adyacente a la habitación del jefe, no es posible entrar utilizando bombas, aunque si se poseen las Gafas de Rayos-X es posible entrar, aunque no se marcará en el mapa como habitación del jefe hasta que el jugador entre.
En algunas ocasiones, una puerta hacia la habitación del diablo puede aparecer al derrotar al jefe.
Es posible caer por la trampilla accidentálmente tras derrotar al jefe en caso de que Isaac se encuentre cerca de donde aparece, perdiendo la posibilidad de cojer el objeto.
Habitación del desafío
La habitación del desafío, puede ser reconocida por el marco de su puerta (Un par de espadas cruzadas). Solo se puede entrar si el jugador tiene la vida completa (O el equivalente de la vida completa, sumando corazones normales con corazones de alma), o se tiene el objeto "El clavo" o "Señor del foso". Es posible entrar sin tener la vida completa si tiene una habitación secreta colindante y se rompe que une ambas habitaciones con una bomba, de todas maneras, no se puede salir de la habitación del desafío con bombas a no ser que todos los enemigos hayan sido eliminados.
Una vez dentro, el jugador encontrará un cofre o un objeto. Una vez abierto el cofre o recogido el objeto, el jugador tendrá que derrotar tres oleadas de enemigos antes de poder salir de la habitación, como en las habitaciones de combate, un corazón, moneda, llave, bomba, pildora o carta de tarot aparecerá en el centro al derrotar a los enemigos. Esta habitación puede aparecer a partir del segundo nivel.
Nota: El jugador puede invocar las tres oleadas de enemigos al mismo tiempo pulsando el botón de pausa inmediatamente después de cojer el botín de la habitación. Esto puede pasar también si se desbloquea algún secreto justo cuando las oleadas van a aparecer, por ejemplo, al abrir el cofre si el jugador recoje una moneda, sumando 55 con las que ya tenia, saltará el desbloqueo de Cain, y aparecerán todas las oledas.
Salón de juegos
The arcade. The heart on the right spawned upon entry; other items can too.
El salón de arcade contiene tres juegos para que los jugadores apuesten. Entrar cuesta una moneda. Dentro, el jugador encontrará una Maquina Tragaperras, una Maquina de Donación de Sangre, y el juego de la calavera. Un objeto, como una moneda o un corazón puede aparecer al entrar.
Los salones de juegos pueden aparecer en cualquier nivel menos en el primero.
- Maquina Tragaperras: Los jugadores pueden apostar monedas para tener una oportunidad de ganar pildoras, bombas, llaves, corazones, moscas o mas monedas. Algunas veces invocará una mosca hostil en su lugar. Acaba rompiendose tras un número de usos aleatorios, al hacerlo, caerán objetos comunes al suelo o el Dolar.
- Maquina de donación de sangre: Los jugadores pueden cambiar vida por un número aleatorio de monedas. Cada transacción cuesta medio corazón, excepto en el cuarto capítulo, donde cuesta un corazón entero. Se rompe tras un número aleatorio de usos, al hacerlo, aparecerá el objeto Bolsa de Sangre.
Nota: Los objetos Mi Pequeño Unicornio, El carro, El libro de Sombras, y el Game Kid permiten usar 'la maquina sin perder corazones.
- Juego de la calavera: Los jugadores pueden apostar a cual de las tres calaveras tiene un objeto oculto debajo. Puede ser un corazón (1/2 corazón, corazón completo, corazón de alma), una bomba (normal, troll, 2x1), una llave, o un objeto especial (Escatol). Si el jugador falla, una mosca hostil aparecerá para atacar al jugador. La animación del trilero al mover las calaveras es siempre la misma, de modo que se tiene un 33% de posibilidades de acertar.
- Destruir cualquiera de estos con una bomba, hará aparecer objetos comunes.
Habitación del Mini-Jefe
El jugador debe pelear con una manifestación de uno de los Siete Pecados Capitales. La distribución de esta habitación depende del pecado contra el que se pelee. Estas habitaciones aparecen en el mapa como un craneo mas pequeño que los utilizados para indicar la habitación del Jefe.
No se puede abrir la puerta con una bomba para escapar, ni entrar a través de una habitación secreta.
Habitación secreta
A Secret Room, with the We Need to Go Deeper Item
The Secret Room typically contains no enemies and 3-9 coins (usually pennies, with slight chances for nickels), a slot machine, or an item. The "sin" mini-boss Greed will sometimes appear in a secret room instead - the Compass will show if he resides there.
The items that can be found in the secret room are 1UP, Bob's Rotten Head, Book of Belial, Raw Liver, Spider's Bite, Transcendence, Teleport!, and We Need to Go Deeper. Some of these items are more common than others.
The room is normally unmarked on the map, although the Treasure Map will show it automatically. The player must bomb the wall of an adjacent room (in the middle, where a door would be) to gain access. X-Ray Vision will automatically reveal entrances and forego the need to bomb, and with the Spelunker's Hat a chime will play when entering such a room, otherwise its location must be guessed. The Secret Room tends to border 3 or 4 normal rooms, a good indication of where to try.
Greed in a secret room
Entrances created to the Secret Room close upon leaving it. The player can bomb into other adjacent rooms from inside, but without X-Ray Vision will not be able to enter Boss or Challenge rooms in this manner.
Usually you can find secret rooms when you look at the map. When you see a "c" or a "horseshoe" looking thing, it should be there. Example:
- are normal rooms, ? is secret room
- - -
-?-
Devil Room
The Devil Room, with the We Need to Go Deeper and Guppy items.
The Devil Room is available randomly after the player has killed a level boss. There is a higher chance, almost guaranteed to appear if no damage is taken during the boss fight. The room can also be entered randomly when using Teleport!. It behaves like a regular shop, except instead of spending coins, the player can exchange hearts or soul hearts for powerful items. There are only 3 costs for items: 1 heart/3 soul hearts and 2 hearts. Some items only appear in these rooms and don't appear in any treasure room. Once the hearts are spent, they cannot be recovered until more heart containers are collected. If you purchase an item which costs your entire HP total, it will reduce you to no HP, and you will die instantly upon taking any further damage. If you purchase an item that costs more than your entire HP total, it will kill you instantly (after the upgrade). It is possible to destroy the rock that the devil is sitting on, allowing the player to pass through him (though this serves no purpose, as the devil cannot be killed and so drops no items, money, or hearts).
Bugs:
- If you have hearts and soul hearts and make a purchase that uses all of your regular hearts, you will also lose all of your soul hearts. You will then have no hearts shown in the top right but still be alive.
- If you have hearts and soul hearts and make a purchase that uses all of your regular hearts, you can be killed despite still having soul hearts.
- If you have a 1-Up and you make a deal that kills you, you will come back with no heart capacities, and will still be alive, and you will be unable to gain more heart capacities.
Special Rooms
- I am Error