En The Binding of Isaac, la estructura de las mazmorras está generada aleatóriamente. Igualmente, hay cuatro habitaciónes que están siempre presentes en los tres primeros capítulos: la habitación del tesoro, la habitación del jefe, la tienda, y el cuarto secreto. A partir del cuarto capítulo desaparecen la habitación del tesoro y la tienda, dejando solo la habitación secreta y el cuarto del jefe. También existen tres habitaciones mas, que pueden aparecer ocasionálmente, la habitación de desafio, el salón de juegos o la habitación del minijefe.
Distribución de las habitaciones
Las habitaciones pueden contener de una a cuatro puertas, piedras, heces, enemigos, fuego, fosas, cofres y objetos. Las habitaciones normales pueden ser habitaciones puzzle, donde el jugador puede intentar sortear unos obstaculos para conseguir objetos, o habitaciones de combate, donde el jugador debe derrotar a todos los enemigos antes de poder salir (en ocasiones puede aparecer un botín en el centro de la habitación al derrotar a todos los enemigos, que puede ser un corazón, una moneda, una llave, una bomba, o raramente una bomba troll)
La distribución de las habitaciónes al igual que la estructura de las mazmorras está generada aleatóriamente, con un número o tipo de enemigos distintos (en diferentes posiciones), piedras (pueden ser de diversos tipos), cofres y objetos.
La habitación del tesoro, la tienda, la habitación del jefe, la habitación del desafío, el salón de juegos y la habitación del minijefe solo pueden tener una habitación normal adyacente a ellos.
Habitación del tesoro 
Una habitación del tesoro
La habitación del tesoro (también llamada habitación o cuarto del objeto) es una habitación sin enemigos, con un objeto en el centro de un pedestal. Siempre hay una en los niveles de los tres primeros capítulos. Para entrar se necesita una llave (excepto en el primer nivel del primer capítulo, donde no hace falta), o dos bombas en caso de que haya una habitación secreta adyacente. Dicha habitación se identifica por tener una puerta con el borde dorado en el juego, y por una corona dorada en el mapa.
Tienda 
Para entrar el jugador necesita una llave, o dos bombas en caso de que haya una habitación secreta adyacente. En esta habitación el jugador puede comprar objetos a un hombre ahorcado. Los precios son:
Una tienda con varios objetos a la venta
- 3 monedas por corazón
- 5 monedas por bomba, llave, corazones de fé, pildoras y cartas de tarot.
- 15 monedas por objeto de mejora o objeto utilizable
A veces los precios pueden verse reducidos a la mitad, en cuyo caso se mostrará el precio en rojo. En raras ocasiones, los objetos podrán cambiarse a cambio de un número de corazones de la vida máxima del jugador, como ocurre en la habitación del diablo. El minijefe del pecado "Codicia" aparece en ocasiones en esta habitación, reemplazando a la tienda en ese nivel aunque sea derrotado.
Las tiendas suelen vender la Escalera, las Pilas, el Descuento de Steam, el Libro de las Revelaciones, el Mapa del Tesoro, y la Brújula. Otros objetos también aparecen, pero poco a menudo.
Ocasionalmente, los objetos ofertados en la tienda pueden cambiar despues de una visita. Esto puede ser un error del juego. (Los objetos rebajados suelen cambiar cuando el jugador completa una habitación del desafio)
Si el jugador posee el Rosario, pueden haber objetos duplicados en la tienda.
Habitación del mendigo
Una habitación del mendigo.
La Habitación del Mendigo es un cuarto que aparece aleatoriamente con un mendigo en el centro. Esta habitación aparece como una maquina tragaperras en el mapa, ya que el mendigo al igual que la maquina tragaperras es un juego de suerte.
Chocar con el hace que el jugador pierda una moneda y da la posibilidad de que el mendigo haga aparecer una llave, una bomba, una bomba troll, un corazón, un corazón de alma o un objeto. Se puede chocar contra el las veces que el jugador quiera, perdiendo una moneda en cada choque, hasta que el mendigo deje caer un objeto de mejora o un objeto utilizable, momento en el que desaparecerá de la habitación.
Los mendigos pueden matarse con bombas, al morir dejan caer un objeto comun (corazones, bombas, llaves, monedas)
Tambien hay dos tipos de mendigos.El primero es el normal que te pide monedas a cambio de llaves,bombas,corazones y a veces objetos.El segundo mendigo es un pequeño diablo que te pide corazones a cambio de bombas,llaves,objetos y hasta mejoras, pero NUNCA te da corazonas.
Es posible que haya mas de una habitación de mendigo en un mismo nivel, ya sea por casualidad o porque se ha usado la carta de Juicio del Tarot.
Habitación del jefe
Encuentro con Larry Jr.
Para escapar de cada uno de los niveles el jugador debe entrar a esta habitación y derrotar al jefe (a no ser que se utilice el objeto "Necesitamos adentrarnos mas". La habitación del jefe se indica en el mapa como un craneo, y en el juego se reconoce porque la puerta que lleva a el tiene un craneo en el marco.
Los jefes dejan caer objetos (dependiendo del jefe, puede ser objeto de mejora (jefes comunes), un objeto unico que solo deja caer un jefe determinado (jefes alternativos, jinetes del apocalipsis) o un objeto de la habitación del diablo (El Caido)), de uno a tres corazones (dependiendo de si el secreto "Todo es terrible" está desbloqueado o si el jefe tiene un color alternativo), y una trampilla al siguiente nivel.
Aunque se de el caso de que hay una habitación secreta adyacente a la habitación del jefe, no es posible entrar utilizando bombas, aunque si se poseen las Gafas de Rayos-X es posible entrar, aunque no se marcará en el mapa como habitación del jefe hasta que el jugador entre.
En algunas ocasiones, una puerta hacia la habitación del diablo puede aparecer al derrotar al jefe.
Es posible caer por la trampilla accidentálmente tras derrotar al jefe en caso de que Isaac se encuentre cerca de donde aparece, perdiendo la posibilidad de coger el objeto.
Habitación del desafío
La habitación del desafío, puede ser reconocida por el marco de su puerta (Un par de espadas cruzadas). Solo se puede entrar si el jugador tiene la vida completa (O el equivalente de la vida completa, sumando corazones normales con corazones de alma), o se tiene el objeto "El clavo" o "Señor del foso". Es posible entrar sin tener la vida completa si tiene una habitación secreta colindante y se rompe que une ambas habitaciones con una bomba, de todas maneras, no se puede salir de la habitación del desafío con bombas a no ser que todos los enemigos hayan sido eliminados.
Una vez dentro, el jugador encontrará un cofre o un objeto. Una vez abierto el cofre o recogido el objeto, el jugador tendrá que derrotar tres oleadas de enemigos antes de poder salir de la habitación, como en las habitaciones de combate, un corazón, moneda, llave, bomba, pildora o carta de tarot aparecerá en el centro al derrotar a los enemigos. Esta habitación puede aparecer a partir del segundo nivel.
Nota:
- El jugador puede invocar las tres oleadas de enemigos al mismo tiempo pulsando el botón de pausa inmediatamente después de cojer el botín de la habitación. Esto puede pasar también si se desbloquea algún secreto justo cuando las oleadas van a aparecer, por ejemplo, al abrir el cofre si el jugador recoje una moneda, sumando 55 con las que ya tenia, saltará el desbloqueo de Cain, y aparecerán todas las oleadas.
- A partir de la versión 1.15 de WoTL a los jugadores que consiguen la habilidad de volar ya no pueden salir y entrar de las habitaciones del desafío cerradas.
Salón de juegos
Los tres objetos finales de los juegos
Salón de juego
El salón de arcade contiene tres juegos para que los jugadores apuesten. Entrar cuesta una moneda. Dentro, el jugador encontrará una Maquina Tragaperras, una Maquina de Donación de Sangre, y el juego de la calavera. Un objeto, como una moneda o un corazón puede aparecer al entrar.
Los salones de juegos pueden aparecer en cualquier nivel menos en el primero.
- Maquina Tragaperras: Los jugadores pueden apostar monedas para tener una oportunidad de ganar pildoras, bombas, llaves, corazones, moscas o mas monedas. Algunas veces invocará una mosca hostil en su lugar. Acaba rompiendose tras un número de usos aleatorios, al hacerlo, caerán objetos comunes al suelo o el Dolar.
- Maquina de donación de sangre: Los jugadores pueden cambiar vida por un número aleatorio de monedas. Cada transacción cuesta medio corazón, excepto en el cuarto capítulo, donde cuesta un corazón entero. Se rompe tras un número aleatorio de usos, al hacerlo, aparecerá el objeto Bolsa de Sangre.
Nota: Los objetos Mi Pequeño Unicornio, El carro, El libro de Sombras, y el Game Kid permiten usar 'la maquina sin perder corazones.
- Juego de la calavera: Los jugadores pueden apostar a cual de las tres calaveras tiene un objeto oculto debajo. Puede ser un corazón (1/2 corazón, corazón completo, corazón de alma), una bomba (normal, troll, 2x1), una llave, o un objeto especial (Escatolle). Si el jugador falla, una mosca hostil aparecerá para atacar al jugador. La animación del trilero al mover las calaveras es siempre la misma, de modo que se tiene un 33% de posibilidades de acertar.
- Destruir cualquiera de estos con una bomba, hará aparecer objetos comunes.
Habitación del Mini-Jefe
El jugador debe pelear con una manifestación de uno de los Siete Pecados Capitales. La distribución de esta habitación depende del pecado contra el que se pelee. Estas habitaciones aparecen en el mapa como un craneo mas pequeño que los utilizados para indicar la habitación del Jefe.
No se puede abrir la puerta con una bomba para escapar, ni entrar a través de una habitación secreta.
Habitación secreta
Habitación secreta con Necesitamos ir mas Profundo
La habitación secreta contiene normalmente de tres a nueve monedas (normalmente centavos, raramente monedas de cinco centavos), una Máquina Tragamerras, o un objeto. El minijefe del pecado Codicia aparece a veces en la habitación secreta reemplazando los objetos o monedas. La Brujula mostrará si se encuentra dentro.
Los objetos que se pueden encontrar en la Habitación Secreta son 1Vida, La Cabeza Podrida de Bob, El Libro de Belial, Hígado Crudo, Picadura de Araña, Trascendencia, Teletransporte y Necesitamos ir mas profundo. Algunos objetos aparecen mas a menudo que otros.
Esta habitación no viene marcada en el mapa, a no ser que se posea el mapa del tesoro. El jugador debe poner una bomba en la pared adyacente (en el medio, donde debería estar la puerta) para conseguir entrar. Las Gafas de Rayos-X permiten entrar sin necesidad de bomba, y el Casco de Minero reproducirá un sonido al entrar en una habitación que contenga una entrada a la habitación secreta, aunque la ubicación de la puerta debe descubrirse. La habitación secreta suele tener de 3 a 4 habitaciones normales adyacentes a ella, de esta forma puede intuirse donde se encuentra.
Codicia en la Habitación Secreta
La entrada a la habitación secreta se cerrará al salir de ella. El jugador puede poner bombas en las paredes de la habitación secreta para entrar a otras habitaciones adyacentes a ella, aunque sin el objeto Gafas de Rayos-X no se podrá entrar en habitaciones de Jefe o habitaciones de Desafío de esta manera.
Se puece encontrar habitaciones secretas mirando el mapa. Cuando se ve una "c" o "herradura" formada por habitaciones. Ejemplo:
Habitación normal -
Habitación secreta ?
---
-?-
Habitación del Diablo
Habitación del diablo
La habitación del Diablo está disponible aleatóriamente despues de que el jugador derrote a un Jefe. Las posibilidades de que aparezca aumentan si no se ha recibido daño durante el combate con el Jefe. También es posible entrar aleatóriamente usando Teletransporte. El funcionamiento es como el de una Tienda, pero en lugar de usarse monedas para comprar se usan corazones de la vida máxima o corazones de alma a cambio de objetos mas poderosos. Hay solo tres precios por los objetos: 1 corazón/3 corazones de alma o 2 corazones. Algunos objetos solo aparecen en la Habitación del Diablo, y no pueden encontrarse en habitaciones de tesoro ni en tiendas. Una vez gastados los corazones, no se pueden recuperar a no ser que se consigan mas objetos que aumenten la vida máxima. Si se compra un objeto cuyo coste sea igual a la vida total máxima del jugador, el jugador morirá instantaneamente al recibir cualquier golpe. Si se compra un objeto que tenga un coste superior a la vida máxima del jugador, morirá tras conseguir el objeto. Es posible destruir la estatua del Diablo usando una bomba, permitiendo al jugador pasar por donde se encontraba la estatua (Aunque no sirve de nada, puesto que destruirla no hará caer ningún objeto).
Aveces entrar en esta sala provoca un encuentro con un mini boss, Kramphus, es un demonio que lanza rayos de sangre en cruz ( + ) y lanzar 3 veces seguidas 4 bolas de sangre, al derrotarlo arroja el objeto coal y te dice que es un regalo de navidad para tí, osea quiere decir que eres un niño malo ya que te da carbón para navidad.
Bugs:
- Si se tienen corazones y corazones de alma y se realiza una compra que usa mas corazones normales de los que tiene el jugador, se perderán todos los corazones del alma. No se tendrá entonces ningún corazón de ningun tipo pero podrá seguir vivo hasta recibir un golpe.
- Si se tienen corazones y corazones del alma y se hace una compra que use todos los corazones normales, el jugador puede morir a pesar de tener corazones de alma.
- Si se tiene le objeto 1Vida y se hace una compra que puede matar al jugador, se volverá a la vida sin corazones, y se seguirá vivo, a pesar de ser imposible conseguir ningún corazón mas.
Habitacion del sacrificio
Esta habitacion se muestra en el mapa como una gota de sangre.Al entrar habra sangre en las paredes y en el medio habra unos clabos.
Como su nombre lo indica hay que hacer un sacrificio pisando los clabos,al pisarlos normalmente NO te dara absolutamente nada,aunque a veces te dara un cofre o algo pero de igual manera no valdra la pena entrar ahi porque CASI nunca te da nada y gastas corazones para nada.
En todos los niveles aparece menos en el del sotano y adentro de mamá.Al principio te quita un medio corazon pero despues te quita un corazon entero.
Las probabilidades de que te de un cofre o algo pisandolo,es de un 5% recomendable no entrar ahi.